Криопротектор

Криопроте́кторы — вещества, защищающие живые объекты от повреждающего действия замораживания. Криопротекторы используют при криоконсервации — низкотемпературном хранении живых объектов (другими словами, при замораживании клеточных культур, крови, спермы, эмбрионов, изолированных органов и биологических объектов целиком ).

Витрификация имеет важное применение для сохранения эмбрионов, биологических тканей и органов для трансплантации . Стеклование также используется в крионике. для устранения повреждений от замерзания. Криозащитные свойства этих веществ заключаются в понижении температуры стеклования замороженного объекта ниже точки плавления. Таким образом, криопротекторы предотвращают эффективное замерзание, и система сохраняет некоторую гибкость в стеклообразной фазе, таким образом, ведя себя как аморфное твердое тело , которое затвердевает без образования кристаллов, что может повредить образец

В случае биологических образцов повреждение в основном вызвано не кристаллами льда (поскольку внутренняя часть клеток обычно не замерзает таким образом, если вообще не замерзает), а изменениями осмотического давления и ионной силы (содержание электролита в жидкости ячейки). При замораживании на живые объекты воздействуют два повреждающих фактора: формирование внутриклеточного льда и обезвоживание. Помещение живых объектов в растворы криопротекторов и замораживание в этих растворах снижает или исключает полностью формирование внутриклеточного льда и обезвоживание.

Многие криопротекторы также функционируют, образуя водородные связи с биологическими молекулами при замене молекул воды. Водородная связь в водных растворах важна для правильного функционирования белков и ДНК. Следовательно, когда криопротектор заменяет молекулы воды, биологический материал сохраняет свою естественную физиологическую структуру (и функцию), хотя он больше не погружаeтся в водную среду. Такая стратегия сохранения очень часто наблюдается при ангидробиозе. Замена обычной воды на тяжёлую усиливает действие криопротекторов, благодаря образованию более прочных водородных связей.

Существует большое количество веществ, обладающих криопротекторными свойствами, но в медицинской и лабораторной практике используют не более десятка соединений, которые будут перечислены ниже. Различают криопротекторы двух типов: проникающие и непроникающие.

• К проникающим относят криопротекторы, проникающие внутрь клетки. Проникающие криопротекторы препятствуют формированию кристаллов льда за счёт образования водородных связей с молекулами воды. Наиболее распространенные проникающие криопротекторы: глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид.
• К непроникающим относят криопротекторы, не проникающие внутрь клеток. Принцип действия непроникающих криопротекторов до конца не ясен. Вероятно, оно двояко: снижение скорости роста кристаллов и защита клетки от осмотических перепадов. К непроникающим криопротекторам относят две группы веществ: олигосахариды (наиболее часто используют сахарозу и трегалозу) и высокомолекулярные соединения (наиболее часто используют фиколл, альбумин, поливинилпирролидон). Использование непроникающих криопротекторов в отсутствие проникающих неэффективно, то есть непроникающие криопротекторы являются дополнительными компонентами в растворах проникающих криопротекторов.

Криопротекторы работают, увеличивая концентрацию растворенных веществ в клетках. Однако для того, чтобы быть биологически совместимыми, они должны (1) легко проникать в клетки и (2) не быть токсичными для самих клеток. После размораживания живые объекты необходимо освободить от криопротекторов.

Биологические антифризы включают низкомолекулярные соединения и антифризы. Они встречаются, в частности, у организмов арктического климата. Глицерин, другие полиолы, мочевина и глюкоза , среди прочего, используются в качестве низкомолекулярных соединений. Это соединения, которые легко образуют водородные связи с соседними молекулами воды. Cоединения проникая в клеточные мембраны, препятствуют росту кристаллов льда. Это снижает температуру замерзания внутри клеток. В некоторых случаях концентрация воды в клетках также снижается (ангидробиоз ).

Большинство белков-антифризов не препятствуют замерзанию плазмы клеток, но могут немного задержать его. Их действие основано на том факте, что они препятствуют росту кристаллов льда и защищают уже образовавшиеся кристаллы льда, которые могут действовать как зародыши кристаллизации. В результате получаемые кристаллы остаются мелкими, лед становится мелкозернистым и не может разрушить структуры клетки, даже если промерзнет. После оттаивания клетка возобновляет свои нормальные функции.

Белки-антифризы(AFP), относятся к классу полипептидов, продуцируемых некоторыми позвоночными, растениями, грибами и бактериями, которые позволяют им выживать в отрицательных средах. Эти белки связываются с маленькими кристаллами льда и препятствуют их росту и перекристаллизации, что в противном случае было бы фатальным. Также появляется все больше доказательств того, что AFP взаимодействуют с клеточными мембранами клеток млекопитающих, чтобы защитить их от повреждения холодом.

Белки-антифризы не понижают температуру замерзания пропорционально концентрации. Скорее, они работают неколлигативно^[1] . Это позволяет им действовать как антифриз в концентрациях от 1/300 до 1/500 по сравнению с другими растворенными веществами, с последующей минимизацией их влияния на осмотическое давление . Эти необычные способности объясняются их способностью связываться с определенными поверхностями кристаллов льда.

Белки-антифризы создают разницу между точкой плавления льда и точкой замерзания воды, известной как тепловой гистерезис . Добавление белков AFP на границе раздела между льдом и жидкой водой подавляет термодинамически благоприятный рост кристаллов льда . Рост кристаллов кинетически тормозится AFP, которые покрывают поверхности кристаллов льда, доступные для воды.

Наиболее распространенными криопротекторами в промышленности являются различные гликоли , то есть полигидроксоспирты ( этиленгликоль , пропиленгликоль , глицерин ). Этиленгликоль входит в состав жидкостей для зимних автомобильных радиаторов, а пропиленгликоль иногда используется для уменьшения количества кристаллов льда в мороженом и получения более гладкой массы. Другой популярный криопротектор - диметилсульфоксид вместе с глицерином, обычно используемый для защиты биологических образцов (спермы, эмбрионы) во время их хранения в жидком азоте.

Для повышения эффективности криопротекторов и смягчения побочных эффектов от их применения чаще всего используются их смеси. Смесь формамида с диметилсульфоксидом, пропиленгликолем и соответствующим коллоидом долгое время была наиболее эффективным искусственно созданным криопротектором.

Витрификация широко используется в качестве метода криоконсервации эмбрионов и ооцитов. Указанное стеклование достигается за счет очень быстрого охлаждения, при котором используется высококонцентрированный раствор, который не кристаллизуется при замораживании, так что его вязкость увеличивается с понижением температуры до образования аморфного твердого состояния. Скорость снижения температуры достигает 23000 ° С / мин. Чтобы добиться большого изменения температуры на высокой скорости, используется минимальный объем среды (менее 0,1 микролитра) и жидкий азот при -196 ° C. Скорость воздействия и замораживания должна быть достаточно высокой, чтобы избежать токсичности и образования внутриклеточных кристаллов, которые могут повредить содержимое клетки. Чтобы добиться очень быстрого обезвоживания, используются криопротекторы в высоких концентрациях. Скорость замораживания / оттаивания косвенно пропорциональна концентрации криопротекторов. Перед замораживанием биологический материал должен быть уравновешен этим криозащитным раствором (в более низкой концентрации), чтобы он мог выдержать осмотический шок. Выживаемость образцов превышает 90%, и эмбрионы обычно выживают в целости и сохранности.

После точной настройки витрификации в лаборатории выживаемость превышает 90%, независимо от типа образца. Эмбрионы обычно выживают неповрежденными (100% бластомеров). Этот метод полезен как для эмбрионов, так и для ооцитов, но не для сперматозоидов. Чрезвычайная скорость требуется в процессе расстекловывания (оттаивания), удаления пробы из жидкого азота и введения ее в середину при 37 ° C. Некоторые исследования подчеркивают, что эта скорость оттаивания может быть более важной, чем скорость замораживания, для достижения высокой выживаемости криоконсервированных ооцитов.

• Аморфный лёд
• Анабиоз

• Best B P Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Res. 2015 Oct;18(5):422-36. doi: 10.1089/rej.2014.1656. Epub 2015 Sep 22. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4620521/
• Кен Малдрю. Краткий курс криобиологии. 1999. Университет Калгари. Канада. на англ.яз. / Ken Muldrew. Cryobiology — A Short Course. 1999
• Дж. Вольф и Г. Брайант. Криобиология и биология обезвоживания клеток. 2004. Университет Нью-Саус-Уэлса, Сидней, Австралия. на англ.яз. / J.Wolfw and G.Bryant. Cryobiology and anhydrobiology of cells. 2004.
• Белоус А. М., Грищенко В. И. / Криобиология. — Киев, «Наукова думка», 1994, — 432 с.
• Урмацких А.В. "Способ криоконсервации клеток, органов, тканей и организмов". RU 2804972 C2, 05.04.2022.

В статье есть список источников, но не хватает сносок. Без сносок сложно определить, из какого источника взято каждое отдельное утверждение. Вы можете улучшить статью, проставив сноски на источники, подтверждающие информацию. Сведения без сносок могут быть удалены. (24 февраля 2023)