SDHB
Mitohondrijska podjedinica gvožđe-sumorne ubikinonske sukcinat-dehidrogenaze (SDHB), znana i kao podjedinica gvožđe-sumpornog kompleksa II (Ip) jest protein/enzim koji je kod ljudi kodiran genom SDHB sa hromosoma 1.[5][6][7]
Sukcinat-dehidrogenaza (takođe zvana SDH ili kompleks II) je proteinski kompleks katalizira oksidaciju sukcinata (sukcinat + ubikinon => fumarat + ubihinol). SDHB je jedna od četiri proteinske podjedinice koje formiraju sukcinat-dehidrogenazu, a ostale tri su SDHA, SDHC i SDHD. Podjedinica SDHB je povezana sa podjedinicom SDHA na hidrofilnom, katalitskom kraju SDH kompleksa. Takođe je povezan sa podjedinicama SDHC/SDHD na hidrofobnom kraju kompleksa usidrenog u mitohondrijskoj membrani. Podjedinica je protein gvožđe-sumpor sa tri klastera gvožđe-sumpor. Teška je 30 kDa.
Aminokiselinska sekvenca
[uredi | uredi izvor]Dužina polipeptidnog lanca je 280 aminokiselina, a molekulska težina 31.630 Da.[8]
| 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MAAVVALSLR | RRLPATTLGG | ACLQASRGAQ | TAAATAPRIK | KFAIYRWDPD | ||||
| KAGDKPHMQT | YEVDLNKCGP | MVLDALIKIK | NEVDSTLTFR | RSCREGICGS | ||||
| CAMNINGGNT | LACTRRIDTN | LNKVSKIYPL | PHMYVIKDLV | PDLSNFYAQY | ||||
| KSIEPYLKKK | DESQEGKQQY | LQSIEEREKL | DGLYECILCA | CCSTSCPSYW | ||||
| WNGDKYLGPA | VLMQAYRWMI | DSRDDFTEER | LAKLQDPFSL | YRCHTIMNCT | ||||
| RTCPKGLNPG | KAIAEIKKMM | ATYKEKKASV |
Struktura
[uredi | uredi izvor]Gen koji kodira SDHB protein je jedarna, a ne mitohondrijska DNK. Međutim, eksprimirani protein se nalazi u unutrašnjoj mitohondrijskoj membrani. Lokacija gena kod ljudi je na hromosom u 1 na lokusu p36.1-p35. Gen kodira 1.162 bazna para, podijeljenih u osam egzona.[5] Eksprimirani protein teži 31,6 kDa i sastoji se od 280 aminokiselina.[9][10] SDHB sadrži klaster gvožđe-sumpor neophodan za tuneliranje elektrona kroz kompleks. Nalazi se između SDHA i dvije transmembranske podjedinice SDHC i SDHD.[11]
Funkcija
[uredi | uredi izvor]SDH kompleks nalazi se na unutrašnjoj membrani mitohondrija i učestvuje u ciklusu limunske kiseline i respiratorni lanac. SDHB djeluje kao intermedijer u osnovnom djelovanju SDH enzima prikazanom na slici 1:
- SDHA pretvara sukcinat u fumarat kao dio ciklusa limunske kiseline. Ova reakcija također pretvara flavin adenin-dinukleotid (FAD) u FADH2.
- Elektroni iz FADH2 prenose se u SDHB podjedinicu gvožđevog klastera [2Fe-2S], [4Fe-4S], [3Fe-4S].
- Konačno, elektroni se prenose u ubikinon (Q) bazen preko podjedinice SDHC/SDHD. Ova funkcija je dio respiratornog lanca.
U početku, SDHA oksidira sukcinat putem deprotonacije na mjestu vezivanja FAD, formirajući FADH2 i ostavljajući fumarat, labavo vezan za aktivno mjesto, slobodno izlaze iz proteina. Elektroni iz FADH2 se prenose u SDHB podjedinicu gvožđe-klastera [2Fe-2S], [4Fe-4S], [3Fe-4S] i tunel duž [ Fe-S] releja sve dok ne stignu u [3Fe-4S] klaster gvožđe-sumpor. Elektroni se zatim prenose na molekulu ubikinona koji čeka na aktivnom mestu Q pula u dimeru SDHC/SDHD. O1 karbonil kisik ubikinona je orijentiran na aktivnom mestu (slika 4) interakcijom vodikovih veza sa Tyr83 SDHD-a. Prisustvo elektrona u klasteru gvožđe-sumpor [3Fe-4S] izaziva kretanje ubikinona u drugu orijentaciju. Ovo olakšava drugu interakciju vodikove veze između O4 karbonil grupe ubikinona i Ser27 SDHC. Nakon prvog koraka redukcije jednog elektrona, formira se semikinonska radikalna vrsta. Drugi elektron stiže iz klastera [3Fe-4S], kako bi osigurao potpunu redukciju ubikinona u ubikinol.[12]
Klinički značaj
[uredi | uredi izvor]Klicine mutacije u genu mogu uzrokovati porodični paragangliom (u staroj nomenklaturi, Paragangliom tip PGL4). Isto stanje se često naziva porodičnim feohromocitomom. Rjeđe, ovom mutacijom može biti uzrokovan karcinom bubrežnih ćelija.
Paragangliomi povezani sa SDHB mutacijama imaju visoku stopu maligniteta. Kada je maligni, liječenje je hitno, isto kao i za bilo koji maligni paragangliom/feohromocitom.
Kancer
[uredi | uredi izvor]Paragangliomi uzrokovani SDHB mutacijama imaju nekoliko karakteristika:
- Malignost je uobičajena, u rasponu od 38%-83%[13][14] kod nositelja bolesti. Nasuprot tome, tumori uzrokovani mutacijama SDHD-a su gotovo uvijek benigni. Sporadični paragangliomi su maligni u manje od 10% slučajeva.
- Maligni paragangliomi uzrokovani SDHB su obično (možda 92%[14]) vannadbubrežni. Sporadični feohromocitomi/paragangliomi su vanadrenalni u manje od 10% slučajeva.
- Penetrabilnost gena se često navodi kao 77%, do 50. godine života[13] (tj. 77% nositelja će imati najmanje jedan tumor do 50. godine). Ovo je vjerovatno precijenjeno. Od 2011., porodice sa tihim SDHB mutacijama se provjeravaju[15] za određivanje frekvencije tihih nositelja.
- Prosječna starost početka je približno ista za SDHB u odnosu na bolest koja nije povezana sa SDHB (približno 36 godina).
Mutacije koje uzrokuju bolest su uočene u egzonima 1 do 7, ali ne i 8. Kao i kod SDHC i gena SDHD, SDHB je gen supresije tumora.
Formiranje tumora općenito slijedi Knudsonovu hipotezu "dva pogotka". Prva kopija gena je mutirana u svim ćelijama, ali druga kopija funkcionira normalno. Kada druga kopija mutira u određenoj ćeliji zbog slučajnog događaja, javlja se gubitak heterozigotnosti (LOH) i SDHB protein se više ne proizvodi. Tada postaje moguće formiranje tumora.
S obzirom na osnovnu prirodu SDH proteina u svim ćelijskim funkcijama, još nije razumljivo zašto su zahvaćene samo paraganglijske ćelije. Međutim, osjetljivost ovih ćelija na nivo kisika može imati ulogu.
Putevi bolesti
[uredi | uredi izvor]Precizan put koji vodi od mutacije SDHB do tumorigeneze nije određen; postoji nekoliko predloženih mehanizama.[16]
Generiranje reaktivnih vrsta kisika
[uredi | uredi izvor]
Kada je aktivnost sukcinat-ubikinon inhibirana, elektroni koji bi normalno prešli kroz SDHB podjedinicu u zbir ubikinona se umjesto toga prenose u O2, kako bi se stvorile vrste reaktivnog kisika (ROS) kao što je superoksid. Isprekidana crvena strelica na slici 2 to pokazuje. ROS akumuliraju i stabilizuju proizvodnju HIF1-α. HIF1-α se kombinuje sa HIF1-β da bi formirao stabilan HIF heterodimerni kompleks, što zauzvrat dovodi do indukcije antiapoptotskih gena u ćelijskom jedru.
Akumulacija sukcinata u citosolu
[uredi | uredi izvor]Inaktivacija SDH može blokirati oksidaciju sukcinata, pokrećući kaskadu reakcija:
- Sukcinat akumuliran u mitohondrijskom matriksu difundira kroz unutrašnju i vanjsku mitohondrijsku membranu do citosola (ljubičaste isprekidane strelice na slici 2).
- Pod normalnom ćelijskom funkcijom, HIF1-α u citosolu se brzo hidroksilira pomoću prolil-hidroksilaza (PHD), prikazana svijetloplavom strelicom. Ovaj proces blokira nagomilani sukcinat.
- HIF1-α se stabilizuje i prelazi u ćelijsko jedro (narandžasta strelica) gde se kombinuje sa HIF1-β da formira aktivni HIF kompleks koji indukuje ekspresiju gena koji izazivaju tumor.[17]
Ovaj put otvara mogućnost terapijskog tretmana. Nakupljanje sukcinata inhibira aktivnost PHD. PHD djelovanje normalno zahtijeva kiseonik i α-ketoglutarat kao kosupstrat i gvožđe i askorbat kao kofaktore. Sukcinat se takmiči sa α-ketoglutaratom u vezivanju za enzim PHD. Stoga, povećanje nivoa α-ketoglutarata može ublažiti efekat akumulacije sukcinata.
Normalan α-ketoglutarat ne prožima ćelijske zidove efikasno, te je potrebno stvoriti derivat koji prožima ćeliju (npr. α-ketoglutarat esteri). In vitro ispitivanja pokazuju da ovaj pristup suplementaciji može smanjiti nivoe HIF1-α i može rezultirati terapijskim pristupom tumorima koji su rezultat nedostatka SDH.[18]
Poremećaj razvojne apoptoze
[uredi | uredi izvor]Paraganglijsko tkivo je izvedeno iz ćelija nervnog grebena prisutnih u embrionu. Abdominalne vannadbubrežne paraganglijske ćelije luče kateholamine koji imaju važnu ulogu u razvoju fetusa. Nakon rođenja ove ćelije obično umiru, što je proces koji je pokrenut opadanjem lučwnja nervnog faktora rasta (NGF) koji inicira apoptozu (ćelijsku smrt).
Ovaj proces ćelijske smrti je posredovan enzimom koji se zove prolil-hidroksilaza EglN3. Akumulacija sukcinata uzrokovana inaktivacijom SDH inhibira prolil hidroksilazu EglN3.[19] Konačni rezultat je da ostaje paranglijsko tkivo koje bi normalno uginulo nakon rođenja, a to tkivo može kasnije izazvati paragangliom/feohromocitom.
Regulacija glikolize
[uredi | uredi izvor]Inhibicija ciklusa limunske kiseline prisiljava ćeliju da glikolitski stvori ATP, kako bi proizvela potrebnu energiju. Inducirani glikolitski enzimi mogu potencijalno blokirati ćelijsku apoptozu.
Editiranje RNK
[uredi | uredi izvor]Transkripti iRNK gena SDHB kod ljudi editiraju se putem nepoznatog mehanizma na ORFovoj nukleotidnoj poziciji 136, uzrokujući konverziju C u U i na taj način stvarajući stop kodon, što rezultira prevođenjem editiranih transkripata u skraćeni SDHB protein sa promenama kiseline R46X aminokiselinom. Ovo editiranje ispoljeno je u monocitima i nekim ljudskim limfoidnim ćelijskim linijama,[20] i pojačana je hipoksija.[21]
Interaktivna mapa puta
[uredi | uredi izvor]Reference
[uredi | uredi izvor]- ^ a b c GRCh38: Ensembl release 89: ENSG00000117118 - Ensembl, maj 2017
- ^ a b c GRCm38: Ensembl release 89: ENSMUSG00000009863 - Ensembl, maj 2017
- ^ "Human PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
- ^ "Mouse PubMed Reference:". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
- ^ a b "Entrez Gene: succinate dehydrogenase complex".
- ^ Kita K, Oya H, Gennis RB, Ackrell BA, Kasahara M (januar 1990). "Human complex II (succinate-ubiquinone oxidoreductase): cDNA cloning of iron sulfur (Ip) subunit of liver mitochondria". Biochem. Biophys. Res. Commun. 166 (1): 101–8. doi:10.1016/0006-291X(90)91916-G. PMID 2302193.
- ^ Au HC, Ream-Robinson D, Bellew LA, Broomfield PL, Saghbini M, Scheffler IE (juli 1995). "Structural organization of the gene encoding the human iron-sulfur subunit of succinate dehydrogenase". Gene. 159 (2): 249–53. doi:10.1016/0378-1119(95)00162-Y. PMID 7622059.
- ^ "UniProt, P21912" (jezik: eng.). Pristupljeno 5. 12. 2021.CS1 održavanje: nepoznati jezik (link)
- ^ Zong NC, Li H, Li H, Lam MP, Jimenez RC, Kim CS, Deng N, Kim AK, Choi JH, Zelaya I, Liem D, Meyer D, Odeberg J, Fang C, Lu HJ, Xu T, Weiss J, Duan H, Uhlen M, Yates JR, Apweiler R, Ge J, Hermjakob H, Ping P (Oct 2013). "Integration of cardiac proteome biology and medicine by a specialized knowledgebase". Circulation Research. 113 (9): 1043–53. doi:10.1161/CIRCRESAHA.113.301151. PMC 4076475. PMID 23965338.
- ^ "SDHB - Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial". Cardiac Organellar Protein Atlas Knowledgebase (COPaKB). Arhivirano s originala, 19. 7. 2018. Pristupljeno 5. 12. 2021.
- ^ Sun, F; Huo, X; Zhai, Y; Wang, A; Xu, J; Su, D; Bartlam, M; Rao, Z (1. 7. 2005). "Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II". Cell. 121 (7): 1043–57. doi:10.1016/j.cell.2005.05.025. PMID 15989954. S2CID 16697879.
- ^ Horsefield, R; Yankovskaya, V; Sexton, G; Whittingham, W; Shiomi, K; Omura, S; Byrne, B; Cecchini, G; Iwata, S (17. 3. 2006). "Structural and computational analysis of the quinone-binding site of complex II (succinate-ubiquinone oxidoreductase): a mechanism of electron transfer and proton conduction during ubiquinone reduction". The Journal of Biological Chemistry. 281 (11): 7309–16. doi:10.1074/jbc.m508173200. PMID 16407191.
- ^ a b Neumann HP, Pawlu C, Peczkowska M, Bausch B, McWhinney SR, Muresan M, Buchta M, Franke G, Klisch J, Bley TA, Hoegerle S, Boedeker CC, Opocher G, Schipper J, Januszewicz A, Eng C (august 2004). "Distinct clinical features of paraganglioma syndromes associated with SDHB and SDHD gene mutations". JAMA. 292 (8): 943–51. doi:10.1001/jama.292.8.943. PMID 15328326.
- ^ a b Brouwers FM, Eisenhofer G, Tao JJ, Kant JA, Adams KT, Linehan WM, Pacak K (novembar 2006). "High frequency of SDHB germline mutations in patients with malignant catecholamine-producing paragangliomas: implications for genetic testing". J. Clin. Endocrinol. Metab. 91 (11): 4505–9. doi:10.1210/jc.2006-0423. PMID 16912137.
- ^ Conference: National Institute of Health (U.S.A.), "SDHB-related Pheochromocytoma: Recent Discoveries & Current Diagnostic and Therapeutic Approaches", September 29, 2006
- ^ Gottlieb E, Tomlinson IP (novembar 2005). "Mitochondrial tumour suppressors: a genetic and biochemical update". Nat. Rev. Cancer. 5 (11): 857–66. doi:10.1038/nrc1737. PMID 16327764. S2CID 20851047.
- ^ Selak MA, Armour SM, MacKenzie ED, Boulahbel H, Watson DG, Mansfield KD, Pan Y, Simon MC, Thompson CB, Gottlieb E (januar 2005). "Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-alpha prolyl hydroxylase". Cancer Cell. 7 (1): 77–85. doi:10.1016/j.ccr.2004.11.022. PMID 15652751.
- ^ MacKenzie ED, Selak MA, Tennant DA, Payne LJ, Crosby S, Frederiksen CM, Watson DG, Gottlieb E (maj 2007). "Cell-permeating alpha-ketoglutarate derivatives alleviate pseudohypoxia in succinate dehydrogenase-deficient cells". Mol. Cell. Biol. 27 (9): 3282–9. doi:10.1128/MCB.01927-06. PMC 1899954. PMID 17325041.
- ^ Lee S, Nakamura E, Yang H, Wei W, Linggi MS, Sajan MP, Farese RV, Freeman RS, Carter BD, Kaelin WG, Schlisio S (august 2005). "Neuronal apoptosis linked to EglN3 prolyl hydroxylase and familial pheochromocytoma genes: developmental culling and cancer". Cancer Cell. 8 (2): 155–67. doi:10.1016/j.ccr.2005.06.015. PMID 16098468.
- ^ Baysal BE (2007). "A recurrent stop-codon mutation in succinate dehydrogenase subunit B gene in normal peripheral blood and childhood T-cell acute leukemia". PLOS ONE. 2 (5): e436. Bibcode:2007PLoSO...2..436B. doi:10.1371/journal.pone.0000436. PMC 1855983. PMID 17487275.
- ^ Baysal BE, De Jong K, Liu B, Wang J, Patnaik SK, Wallace PK, Taggart RT (2013). "Hypoxia-inducible C-to-U coding RNA editing downregulates SDHB in monocytes". PeerJ. 1: e152. doi:10.7717/peerj.152. PMC 3775634. PMID 24058882.
Dopunska literatura
[uredi | uredi izvor]- Milosevic D, Lundquist P, Cradic K, et al. (2010). "Development and validation of a comprehensive mutation and deletion detection assay for SDHB, SDHC, and SDHD". Clin. Biochem. 43 (7–8): 700–4. doi:10.1016/j.clinbiochem.2010.01.016. PMC 3419008. PMID 20153743.
- Alrashdi I, Bano G, Maher ER, Hodgson SV (2010). "Carney triad versus Carney Stratakis syndrome: two cases which illustrate the difficulty in distinguishing between these conditions in individual patients". Fam. Cancer. 9 (3): 443–7. doi:10.1007/s10689-010-9323-z. PMID 20119652. S2CID 21792188.
- Okada Y, Kamatani Y, Takahashi A, et al. (2010). "A genome-wide association study in 19 633 Japanese subjects identified LHX3-QSOX2 and IGF1 as adult height loci". Hum. Mol. Genet. 19 (11): 2303–12. doi:10.1093/hmg/ddq091. PMID 20189936.
- Bayley JP (2010). "Are these compound heterozygous mutations of SDHB really mutations?". Pediatr Blood Cancer. 55 (1): 211, author reply 212. doi:10.1002/pbc.22455. PMID 20213850. S2CID 31378042.
- Rose JE, Behm FM, Drgon T, et al. (2010). "Personalized smoking cessation: interactions between nicotine dose, dependence and quit-success genotype score". Mol. Med. 16 (7–8): 247–53. doi:10.2119/molmed.2009.00159. PMC 2896464. PMID 20379614.
- Gill AJ, Benn DE, Chou A, et al. (2010). "Immunohistochemistry for SDHB triages genetic testing of SDHB, SDHC, and SDHD in paraganglioma-pheochromocytoma syndromes". Hum. Pathol. 41 (6): 805–14. doi:10.1016/j.humpath.2009.12.005. PMID 20236688.
- Martin TP, Irving RM, Maher ER (2007). "The genetics of paragangliomas: a review". Clin Otolaryngol. 32 (1): 7–11. doi:10.1111/j.1365-2273.2007.01378.x. PMID 17298303.
- Eng C, Kiuru M, Fernandez MJ, Aaltonen LA (2003). "A role for mitochondrial enzymes in inherited neoplasia and beyond". Nat. Rev. Cancer. 3 (3): 193–202. doi:10.1038/nrc1013. PMID 12612654. S2CID 20549458.
- Lee J, Wang J, Torbenson M, et al. (2010). "Loss of SDHB and NF1 genes in a malignant phyllodes tumor of the breast as detected by oligo-array comparative genomic hybridization". Cancer Genet. Cytogenet. 196 (2): 179–83. doi:10.1016/j.cancergencyto.2009.09.005. PMID 20082856.
- Hermsen MA, Sevilla MA, Llorente JL, et al. (2010). "Relevance of germline mutation screening in both familial and sporadic head and neck paraganglioma for early diagnosis and clinical management". Cell. Oncol. 32 (4): 275–83. doi:10.3233/CLO-2009-0498. PMC 4619289. PMID 20208144.
- Musil Z; Puchmajerová A; Krepelová A; et al. (2010). "Paraganglioma in a 13-year-old girl: a novel SDHB gene mutation in the family?". Cancer Genet. Cytogenet. 197 (2): 189–92. doi:10.1016/j.cancergencyto.2009.11.010. PMID 20193854.
- Shimada M, Miyagawa T, Kawashima M, et al. (2010). "An approach based on a genome-wide association study reveals candidate loci for narcolepsy". Hum. Genet. 128 (4): 433–41. doi:10.1007/s00439-010-0862-z. PMID 20677014. S2CID 24207887.
- Brière JJ; Favier J; El Ghouzzi V; et al. (2005). "Succinate dehydrogenase deficiency in human". Cell. Mol. Life Sci. 62 (19–20): 2317–24. doi:10.1007/s00018-005-5237-6. PMID 16143825. S2CID 23793565.
- Schimke RN, Collins DL, Stolle CA (2010). "Paraganglioma, neuroblastoma, and a SDHB mutation: Resolution of a 30-year-old mystery". Am. J. Med. Genet. A. 152A (6): 1531–5. doi:10.1002/ajmg.a.33384. PMID 20503330. S2CID 22768946.
- Gill AJ, Chou A, Vilain R, et al. (2010). "Immunohistochemistry for SDHB divides gastrointestinal stromal tumors (GISTs) into 2 distinct types". Am. J. Surg. Pathol. 34 (5): 636–44. doi:10.1097/PAS.0b013e3181d6150d. PMID 20305538. S2CID 2314622.
- Hendrickson SL, Lautenberger JA, Chinn LW, et al. (2010). "Genetic variants in nuclear-encoded mitochondrial genes influence AIDS progression". PLOS ONE. 5 (9): e12862. Bibcode:2010PLoSO...512862H. doi:10.1371/journal.pone.0012862. PMC 2943476. PMID 20877624.
- Cerecer-Gil NY, Figuera LE, Llamas FJ, et al. (2010). "Mutation of SDHB is a cause of hypoxia-related high-altitude paraganglioma". Clin. Cancer Res. 16 (16): 4148–54. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-0637. PMID 20592014.
- Krawczyk A, Hasse-Lazar K, Pawlaczek A, et al. (2010). "Germinal mutations of RET, SDHB, SDHD, and VHL genes in patients with apparently sporadic pheochromocytomas and paragangliomas". Endokrynol Pol. 61 (1): 43–8. PMID 20205103.
- Hes FJ, Weiss MM, Woortman SA, et al. (2010). "Low penetrance of a SDHB mutation in a large Dutch paraganglioma family". BMC Med. Genet. 11: 92. doi:10.1186/1471-2350-11-92. PMC 2891715. PMID 20540712.
- Bailey SD, Xie C, Do R, et al. (2010). "Variation at the NFATC2 locus increases the risk of thiazolidinedione-induced edema in the Diabetes REduction Assessment with ramipril and rosiglitazone Medication (DREAM) study". Diabetes Care. 33 (10): 2250–3. doi:10.2337/dc10-0452. PMC 2945168. PMID 20628086.
- Baysal BE (2007). "A Recurrent Stop-Codon Mutation in Succinate Dehydrogenase Subunit B Gene in Normal Peripheral Blood and Childhood T-Cell Acute Leukemia". PLOS ONE. 2 (5): e436. Bibcode:2007PLoSO...2..436B. doi:10.1371/journal.pone.0000436. PMC 1855983. PMID 17487275.
- Baysal BE, Jong KD, Liu B, et al. (2013). "Hypoxia-inducible C-to-U coding RNA editing downregulates SDHB in monocytes". PeerJ. 1: e152. doi:10.7717/peerj.152. PMC 3775634. PMID 24058882.
Vanjski linkovi
[uredi | uredi izvor]- Database of identified SDHB mutations. Arhivirano 21. 4. 2006. na Wayback Machine
