PCR

PCR (ראשי תיבות באנגלית של Polymerase Chain Reaction, "תגובת שרשרת של פולימראז") היא שיטה מעבדתית המשמשת לשכפול מזורז ("הגברה", או "אמפליפיקציה", בעגה המדעית) של מקטעי DNA.

נהוג להשתמש ב-PCR לסריקה אחר מחלות גנטיות ולביצוע ניתוח השוואתי של DNA מאוכלוסיות שונות, כולל DNA ממינים נכחדים. השיטה חיונית לפענוח פשעים ולקביעת אבהות. מאז שפותחה בראשית שנות ה-80, דחפה את הביולוגיה מולקולרית בצעדי ענק לעבר מעמדה הנוכחי, זאת בעיקר בזכות הקלות והפשטות שבה ניתן להגביר כמויות זעירות של גן נתון פי מיליארדים ובזמן של מספר שעות. על גילוי השיטה זכה קארי מוליס בפרס נובל לכימיה לשנת 1993^[1].

עקרונות הפעולה של ה-PCR

עקרון הפעולה של המכשיר כולל 3 שלבים בכל מחזור: פרימה (Denaturation; דנטורציה בחום), איחוי (Annealing) של תְּחָלִים (פּריימרים) מתאימים לקצוות המקטע שאותו רוצים לשכפל והארכה (Elongation) באמצעות אנזים DNA פולימראז העמיד לחום, המכונה Taq DNA פולימראז. המכשיר חוזר על שלבים אלו, של מחזור ההכפלה, כמה עשרות פעמים (בדרך כלל 25-30), עד להגברה המבוקשת של המקטע.

יעילותו הרבה של המכשיר טמונה ביכולתו לשנות את הטמפרטורה במבחנות במהירות רבה, בזמנים קצובים, ברציפות ולאורך זמן. הפרימה נעשית בדרך-כלל בחום של כ-95 מעלות צלזיוס, האיחוי נעשה בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס (בהתאם לאורך ולהרכב התחלתיים) וההתארכות בטמפרטורה של כ-75 מעלות צלזיוס (שהיא טמפרטורה אופטימלית עבור האנזים Taq דנ"א פולימראז), וחוזר חלילה.

האנזים Taq פולימראז בודד לראשונה מהחיידק העמיד לחום Thermus aquaticus, ומכאן שמו. לפני מציאת האנזים שכפול דנ"א במעבדה היה מורכב ומסורבל בהרבה ודרש החלפה של הפולימראז אחרי כל מחזור, וזאת בשל הפרשי הטמפרטורות הנדרשות לפתיחת הגדילים ולחיבורם לרצף החדש שהורסות את הפולימראז. מאחר שלכל אורך התהליך מתבצעת בו זמנית פתיחה וסגירה של גדילים השכפול מתבצע במשך דורות רבים וללא הפסקה ולכן לאורך כולו יש תהליכים חופפים. קארי מוליס הוא שמצא את האנזים, לאחר שנמצאו אורגניזמים שחיים במעיינות חמים מסוימים, והוא הבין שה-DNA של אורגניזמים אלה משוכפל למרות הטמפרטורה הגבוהה.

כמות התוצרים

בהנחה של יעילות מקסימלית, בכל מחזור מוכפל מספר העותקים במבחנה פי 2. לכן, אם מתחילים עם עותק אחד, הוא ייתן בסוף המחזור הראשון שני העתקים, בסוף המחזור השני ארבעה העתקים, בסוף המחזור השלישי יהיו שמונה, וכך הלאה. הגברה כזאת מכונה הגברה מעריכית. אם מספר הסיבובים הוא n, מספר העותקים יהיה ב- $2^{n}$ . זה גידול מהיר מאוד; לדוגמה, לאחר 30 סיבובים, מספר הגנים במבחנה מוגבר פי יותר ממיליארד.

עם זאת, ההגברה אינה מושלמת שכן ישנם גורמים המגבילים את התהליך, כמו יכולת האנזים לבצע את השכפול שפוחתת עם הזמן ומספר הנוקלאוטידים, שכשיגמרו במבחנה הגידול יתמתן וייעצר.

תוצרים

התוצר של ה-PCR שמכונה אמפליקון הוא גן מוגבר פי מיליארדים, שיכול לשמש לליגציה (החדרת המקטע לפלסמיד כדי לעשות לו טרנספורמציה לחיידקים) או לקביעת רצף של גן.

שיטה זו מנוצלת במהלך CAPS.

גרסאות נוספות של המכשיר

RT-PCR: שיטה זו משמשת להגברת רנ"א באמצעות הפיכתו ל-cDNA עם האנזים רוורס טרנסקריפטאז (Reverse Transcriptase). קיימות גרסאות מתקדמות של המכשיר המשמשות לקביעה כמותית של מקטעי RNA בכמויות זעירות ביותר, כמו בהורמונים.
Real Time PCR: ‏PCR המאפשר לעקוב אחרי כמות מקטעי ה-DNA ששוכפלו בזמן ההרצה במכשיר.

ראו גם

פריימר דיימר

לקריאה נוספת

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2007). Molecular Biology of the Cell, 5th edn, Garland Science, New York. ISBN, 1174808063, 1392.