Recombinase Polymerase Amplification

Die Recombinase Polymerase Amplification (RPA, engl. für ‚Rekombinase-Polymerase-Amplifikation‘) ist eine Methode zur Amplifikation (Vervielfältigung) von DNA. Sie ist eine Variante der isothermalen DNA-Amplifikation.^[1]

Die Recombinase Polymerase Amplification verwendet eine Rekombinase, ein Einzelstrang-bindendes Protein und eine strangversetzende DNA-Polymerase.^[2] Die Rekombinase verstärkt die Bindung eines Primers mit einer Länge von 30 bis 38 Nukleotiden. Durch die Verwendung einer strangversetzenden DNA-Polymerase kann die Reaktion bei einer konstanten Temperatur von 37 bis 42 °C erfolgen, bei Raumtemperatur verläuft die Reaktion etwas langsamer.^[3] Die Reaktion läuft auch ohne Geräte durch Aufbewahrung des Reaktionsgefäßes in der Achsel.^[4] Analog zur RT-PCR kann durch Zusatz einer reversen Transkriptase eine reverse Transkription durchgeführt werden.^[5][6] Analog zur qPCR kann die entstehende DNA quantifiziert werden.^[7] Analog zur Multiplex-PCR können mehrere DNA-Sequenzen parallel amplifiziert werden.^[8]

Alternative Methoden zur Amplifikation von DNA sind z. B. die Polymerasekettenreaktion, die multidisplacement Amplification, die isothermal Assembly, die Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), die Helicase-dependent Amplification (HDA), die Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR), die rolling circle replication (RCA).^[9] Weitere Nachweisverfahren sind z. B. die nicking endonuclease signal amplification (NESA) und nicking endonuclease assisted nanoparticle activation (NENNA), exonuclease-aided target recycling, junction or Y-probes, split DNAZyme und deoxyribozyme amplification (diese beiden letzteren Methoden nutzen DNAzyme alias Desoxyribozyme), nicht-kovalente DNA-Katalysen und die hybridization chain reaction (HCR).^[10]

1. ↑ O. Piepenburg, C. H. Williams, D. L. Stemple, N. A. Armes: DNA detection using recombination proteins. In: PLoS biology. Band 4, Nummer 7, Juli 2006, S. e204, doi:10.1371/journal.pbio.0040204, PMID 16756388, PMC 1475771 (freier Volltext).
2. ↑ J. Kim, C. J. Easley: Isothermal DNA amplification in bioanalysis: strategies and applications. In: Bioanalysis. Band 3, Nummer 2, Januar 2011, S. 227–239, doi:10.4155/bio.10.172, PMID 21250850.
3. ↑ L. Lillis, D. Lehman, M. C. Singhal, J. Cantera, J. Singleton, P. Labarre, A. Toyama, O. Piepenburg, M. Parker, R. Wood, J. Overbaugh, D. S. Boyle: Non-instrumented incubation of a recombinase polymerase amplification assay for the rapid and sensitive detection of proviral HIV-1 DNA. In: PloS one. Band 9, Nummer 9, 2014, S. e108189, doi:10.1371/journal.pone.0108189, PMID 25264766, PMC 4180440 (freier Volltext).
4. ↑ Z. A. Crannell, B. Rohrman, R. Richards-Kortum: Equipment-free incubation of recombinase polymerase amplification reactions using body heat. In: PloS one. Band 9, Nummer 11, 2014, S. e112146, doi:10.1371/journal.pone.0112146, PMID 25372030, PMC 4221156 (freier Volltext).
5. ↑ H. M. Amer, A. Abd El Wahed, M. A. Shalaby, F. N. Almajhdi, F. T. Hufert, M. Weidmann: A new approach for diagnosis of bovine coronavirus using a reverse transcription recombinase polymerase amplification assay. In: Journal of virological methods. Band 193, Nummer 2, November 2013, S. 337–340, doi:10.1016/j.jviromet.2013.06.027, PMID 23811231.
6. ↑ A. Abd El Wahed, P. Patel, D. Heidenreich, F. T. Hufert, M. Weidmann: Reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for the detection of middle East respiratory syndrome coronavirus. In: PLoS currents. Band 5, 2013, S. , doi:10.1371/currents.outbreaks.62df1c7c75ffc96cd59034531e2e8364, PMID 24459611, PMC 3871419 (freier Volltext).
7. ↑ X. Xia, Y. Yu, M. Weidmann, Y. Pan, S. Yan, Y. Wang: Rapid detection of shrimp white spot syndrome virus by real time, isothermal recombinase polymerase amplification assay. In: PloS one. Band 9, Nummer 8, 2014, S. e104667, doi:10.1371/journal.pone.0104667, PMID 25121957, PMC 4133268 (freier Volltext).
8. ↑ S. Kersting, V. Rausch, F. F. Bier, M. von Nickisch-Rosenegk: Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens. In: Microchimica Acta. Band 181, Nummer 13–14, 2014, S. 1715–1723, doi:10.1007/s00604-014-1198-5, PMID 25253912, PMC 4167443 (freier Volltext).
9. ↑ E. C. Oriero, J. Jacobs, J. P. Van Geertruyden, D. Nwakanma, U. D’Alessandro: Molecular-based isothermal tests for field diagnosis of malaria and their potential contribution to malaria elimination. In: The Journal of antimicrobial chemotherapy. September 2014, doi:10.1093/jac/dku343, PMID 25223973.
10. ↑ L. Yan, J. Zhou, Y. Zheng, A. S. Gamson, B. T. Roembke, S. Nakayama, H. O. Sintim: Isothermal amplified detection of DNA and RNA. In: Molecular bioSystems. Band 10, Nummer 5, Mai 2014, S. 970–1003, doi:10.1039/c3mb70304e, PMID 24643211.