НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа

НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа или НАДФ-малик-энзим (НАДФ-МЭ) представляет собой фермент, катализирующий химическую реакцию в присутствии двухвалентных ионов металлов:

(S)-малат + НАДФ⁺ -> пируват + CO₂ + НАДФН

В качестве субстрата фермент использует (S)-малат и НАДФ⁺, при реакции образуются пируват, углекислый газ и НАДФН. В ходе реакции малат окисляется до пирувата и CO₂, а НАДФ⁺ восстанавливается до НАДФН.

Фермент принадлежит к семейству оксидоредуктаз, а точнее, к ферментам, взаимодействующим с СН-OH группой донора, а в качестве акцептора использующих НАД⁺ или НАДФ⁺. Систематическое название этого фермента: (S)-малат: НАДФ⁺ оксидоредуктаза (оксалоацетат-декарбоксилаза). Малатдегидрогеназа участвует в метаболизме пирувата и связывании углерода. НАДФ-малик энзим является одним из трех ферментов декарбоксилирования, участвующих в концентрировании неорганического углерода у С₄ и CAM-растений. Также к этому классу относятся НАД-малик-энзим и ФЕП-карбоксикиназа.^[1][2] Хотя часто одна из трех фотосинтетических декарбоксилаз преобладает, также может встречаться одновременное включение активности всех трех ферментов^[3].

На основе кристаллографических данных гомологичного НАДФ-зависимого малик-энзима млекопитающих, была разработана 3D модель НАДФ-МЭ участвующего в C₄ пути в растениях для выявления основных остатков, обеспечивающих связывание субстрата при катализе. Участок связывания НАДФ⁺ включает в себя два богатых глицином мотива — GXGXXG, гидрофобный желобок с участием минимум шести аминокислотных остатков и отрицательно заряженный остаток на конце ß-нити.^[4][5] Первичная последовательность первого мотива, ²⁴⁰GLGDLG²⁴⁵, является консенсусным маркером для связывания фосфата, что подтверждает участие НАДФ⁺ в связывании, другие глицин-богатые мотивы принимают классическую укладку Россмана — также являющуюся типичным маркером для связывания НАДФ кофактора.^[6] 

Полученные путем искусственного мутагенеза растения кукурузу с дефицитом функции НАДФ-МЭ подтвердждают предложенную молекулярно-биологическую модель. Замена валина глицином в любом месте мотива приводит к полной инактивации фермента. При этом спектральный анализ не показывает существенных отличий от формы дикого типа. Данные свидетельствуют о нарушениях в главном остатке, участвующем в связывании и катализе, а не во междоменном остатке, влияющем на конформационную стабильность. Важную роль играет остаток аргинина в положении 237, взаимодействуя с малатом и НАДФ⁺, он участвует в формировании электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной карбоксильной группой кислоты и фосфатной группой нуклеотида. Не известно, играет ли данный остаток важную роль в субстрат-связывающих взаимодействиях или же определяет положение субстрата при катализе.^[7] Предполагается, что остаток лизина в положении 255 выступает в качестве каталитического основания. Однако, необходимы дальнейшие исследования для точного установления его биохимической роли.

Если рассматривать этот класс ферментов в общем, то малик-энзимы найдены у многих эукариотических организмов (от грибов до млекопитающих). Показана локализация ферментов на субклеточном уровне. Малик энзим присутствует в цитозоле, митохондриях и хлоропластах. В частности, у С₄ растений НАДФ-МЭ локализован в хлоропластах клеток-обкладок проводящего пучка.

В ходе C₄ фотосинтеза — биохимического пути, возникшего для концентрирования CO₂ в месте его фиксации РуБисКО — углекислый газ попадает в клетки мезофилла и образует оксалоацетат. Затем, происходит восстановление оксалоацетата до малата. Малат транспортируется в клетки обкладки, где подвергается декарбоксилированию при участии НАДФ-МЭ. Поскольку в одну клетку обкладки поступает малат от нескольких клеток мезофилла, то в результате происходит концентрирование углекислого газа в месте его фиксации РуБисКо.^[8] 

Роль НАДФ-MЭ в коцентрировании углекислого газа подтверждается исследованием, проведенным на трансгенных растениях. Трансгенные растения с частичной потерей функции НАДФ-MЭ (40% активности НАДФ-ME от активности у дикого типа) наблюдалось значительное снижение уровня фиксации CO₂ даже при высоком межклеточном содержании углекислого газа. Это говорит о важном значении НАДФ-MЭ в регуляции потока углерода, направленного к циклу Кальвина.

Было показано, что экспрессия НАДФ-МЭ регулируется факторами абиотического стресса. Для CAM растений в условиях засухи характерно закрывание устьиц для избегания потери воды в результате испарения, которое приводит к голоданию по СО₂. Этот процесс компенсируется за счёт того, что закрытие устьиц активирует трансляцию НАДФ-MЭ, что в свою очередь, во время коротких периодов поглощения СО₂, увеличивает эффективность усвоения СО2,позволяя таким образом осуществлять фиксацию углерода.

В дополнение к длительному регулированию фермента посредством изменения экспрессии генов, существует кратковременное регулирование, которое может осуществляться за счёт аллостерических механизмов. Было показано, что для частичного ингибирования С₄ НАДФ-МЭ субстратом, малат предположительно должен иметь два независимых сайта связывания: один в активном центре, а второй — аллостерический. Однако, ингибирующий эффект зависит от рН и проявляется лишь при рН = 7, но не 8. Наблюдение за изменением активности фермента в зависимости от изменения рН согласуются с гипотезой о том, что НАДФ-МЭ активен во время фотосинтеза: световые реакции приводят к повышению основности в строме хлоропласта — места локализации НАДФ-МЭ, что приводит к уменьшению ингибирующего влияния малата на НАДФ-МЭ, способствуя тем самым увеличению реакционной способности фермента. И наоборот, замедление световых реакций приводит к повышению кислотности среды в строме, вызывая ингибирование НАДФ-МЭ малатом. Необходимость регуляторного механизма объясняется тем, что для реакций цикла Кальвина требуются высокоэнергетические продукты световой фазы, НАДФН и АТФ, и,соответственно, процесс накопления СО₂ без этих продуктов не является полезным.

Для этого белка можно использовать морфеиновую модель аллостерической регуляции.

НАДФ-малик энзим, как и все остальные С₄ декарбоксилазы, не развился de novo с целью оказания помощи в фиксации СО₂ РуБисКо. Наиболее вероятно, что НАДФ-МЭ был трансформирован из C₃ вида в процессе фотосинтеза, но возможно также и более раннее происхождение из древнего цитозольного предка. В цитозоле, фермент существовал как ряд изоформ "домашнего хозяйства", предназначенных для выполнения различных функций, включая поддержание уровня малата во время гипоксии, удаление микроспор и защиту от патогенов. Относительно механизма эволюции, считается, что С₄ функциональность была вызвана ошибкой внутри промоторных областей при дупликации гена, что привело к его гиперэкспрессии в кодирующей области в клетках обкладки, порождая неофункционализацию. Выбор в пользу сохранения функции фиксирования CО₂, а также повышенной утилизации воды и азота при стрессовых условиях был обусловлен эволюционным давлением.

Установлено, что в ходе эволюции фермент приобрел несколько ключевых функциональных особенностей, в частности: увеличенную каталитическую активность, тетрамерную структуру и способность к pH-зависимому ингибированию собственным субстратом — малатом ^[9]. Сайт-специфический мутагенез, вместе с разрешеним кристаллической структуры C₄-НАДФ-МЭ из сорго и кукурузы позволил установить ряд аминоксилотных остатков, обеспечивающих эти функции:

• Q503, L544 и E339 увеличивают эффективность катализа;
• E339 обеспечивает pH-зависимое ингибирование малатом;
• F140 обеспечивает поддержание олигомерной структуры;
• N-конец участвует в тетрамеризации ^[9].